Den ryske presidenten antydde att hissandet av flaggan speglar vilken sexuell läggning de ambassadanställda har.
Det var under en videokonferens som en parlamentariker berättade för Putin att flaggan vajade utanför den amerikanska ambassaden.
– Vilka arbetar i byggnaden, undrade Putin då och fick "amerikaner" till svar.
– Låt dem fira. Det avslöjar ju ett och annat om människorna som jobbar, fortsatte presidenten leende.
Uttalandet kommer samma dag som Putin undertecknade de författningstillägg som den ryska befolkningen röstade om tidigare i veckan. I ett av tilläggen fastslås att äktenskapet enligt lag ska definieras som en relation mellan man och kvinna.
Sedan 2013 finns en lag som förbjuder gayrelationer hos minderåriga. Den lagen har flera gånger använts för att förbjuda olika prideevenemang i Ryssland.
Under videokonferensen förklarade Putin att lagen från 2013 syftar till att inte "pracka på" barn homosexuella relationer.
– Låt en person växa upp, bli vuxen och bestämma sin egen väg. Tvinga det inte på någon, sade Putin.
Även Storbritannien och ett antal andra länder har haft regnbågsflaggan hissad utanför sina ambassader i Moskva.